長(zhǎng)期共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中使用的NAS（新谷葉-Page改良Neff氏阿米巴鹽水）培養(yǎng)基制備如下：將1克谷草粉（Aldon Corp.,Avon,NY）在1升去離子水中煮沸5分鐘，然后通過(guò)玻璃纖維濾膜（GF/C,Whatman）過(guò)濾。冷卻后，加入5毫升PAS儲(chǔ)備溶液II和I，并用去離子水將最終體積恢復(fù)至1升。
實(shí)驗(yàn)前，將生物體分開培養(yǎng)并準(zhǔn)備如下。對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)，將粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Db11的單個(gè)菌落接種到帶膜濾器蓋（corning）的聚碳酸酯錐形瓶中的80毫升NAS培養(yǎng)基中。將錐形瓶在25°C、120 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48小時(shí)。
收集阿米巴和纖毛蟲細(xì)胞，用40毫升PAS（Page氏阿米巴鹽水）離心（1200 x g，15分鐘）洗滌兩次。離心后，將細(xì)胞重懸于PAS中，并調(diào)整至最終濃度約為10個(gè)細(xì)胞/μL。
為了制備噬菌體儲(chǔ)備液，從半融合平板上收集LB-軟瓊脂（0.7%），與LB培養(yǎng)基混合（每板4毫升），并在37°C下培養(yǎng)3.5小時(shí)。通過(guò)離心（9682 x g，5°C，20分鐘）去除碎片。使用0.2μm Acrodisc®注射器過(guò)濾器（Pall）過(guò)濾儲(chǔ)備液。將噬菌體儲(chǔ)備液在NAS培養(yǎng)基中稀釋1:100,000，得到約10^9 PFU/mL。
長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)在帶有0.2μm疏水濾膜蓋（Sarstedt TC 83.1810.002）的25 cm2聚苯乙烯培養(yǎng)瓶中啟動(dòng)。根據(jù)群落組成，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種1毫升相應(yīng)的微生物，并用NAS培養(yǎng)基將總體積調(diào)整至15毫升。共有五種群落組成處理：（1）細(xì)菌；（2）細(xì)菌+纖毛蟲；（3）細(xì)菌+阿米巴；（4）細(xì)菌+噬菌體；以及（5）細(xì)菌+所有三種敵害。每個(gè)處理重復(fù)36個(gè)培養(yǎng)瓶。
靜態(tài)液體培養(yǎng)物在25°C下培養(yǎng)。每7天，徹底混合每個(gè)培養(yǎng)瓶的內(nèi)容物，并用新鮮的NAS培養(yǎng)基更換50%的體積，使系統(tǒng)成為脈沖資源類型。在每次更新之前，從每個(gè)處理中隨機(jī)選擇四個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行破壞性取樣。
細(xì)菌生物量和原生動(dòng)物種群大小的測(cè)量
從每個(gè)培養(yǎng)瓶的五個(gè)獨(dú)立的400μL樣品中測(cè)量自由水相的細(xì)菌生物量，使用蜂窩板2（Oy Growth Curves Ab Ltd Helsinki,Finland）。使用Bioscreen C®分光光度計(jì)（Oy Growth Curves Ab Ltd）在460-580 nm波長(zhǎng)下測(cè)量光密度（OD）作為生物量。測(cè)量以5分鐘為間隔重復(fù)10次。
為了測(cè)量附著在壁上的粘質(zhì)沙雷氏菌生物膜的量，將15毫升的1%結(jié)晶紫溶液（Sigma-Aldrich St.Louis,Missouri,USA）注入培養(yǎng)瓶。10分鐘后，用蒸餾水沖洗培養(yǎng)瓶三次，然后加入15毫升96%乙醇，將結(jié)晶紫從壁上溶解24小時(shí)。如上所述，通過(guò)結(jié)晶紫-乙醇溶液的吸光度量化形成的生物膜量。使用Bioscreen C分光光度計(jì)在460-580 nm波長(zhǎng)下測(cè)量結(jié)晶紫-乙醇溶液的OD來(lái)量化形成的生物膜量。
噬菌體種群密度可以通過(guò)例如流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量。然而，系統(tǒng)中噬菌體顆粒的總數(shù)并不是一個(gè)有意義的度量，因?yàn)槭删w豐度并不能說(shuō)明噬菌體對(duì)系統(tǒng)中存在的細(xì)菌基因型（或表型）的感染性。但是，我們通過(guò)從每個(gè)培養(yǎng)瓶取三個(gè)獨(dú)立的500μL樣品，確認(rèn)了噬菌體在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在于微觀世界中。為了去除宿主細(xì)菌、阿米巴和纖毛蟲，用氯仿處理樣品，并以17,000 x g離心7分鐘。然后將10微升上清液點(diǎn)滴到含有與200μL過(guò)夜生長(zhǎng)的祖先Db11細(xì)胞混合的0.7%LB-瓊脂上層的1.5%瓊脂平板上，并將平板在25°C下培養(yǎng)過(guò)夜。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有培養(yǎng)瓶的所有樣品都在細(xì)菌菌苔上形成了噬菌斑，證實(shí)了噬菌體在實(shí)驗(yàn)期間沒有滅絕。
為了跟蹤阿米巴的種群動(dòng)態(tài)，小心地將培養(yǎng)瓶倒置，使用奧林巴斯SZX顯微鏡（Olympus Optical Co.,Ltd.Tokyo,Japan）（32倍放大）在暗場(chǎng)模式下從微觀世界底壁數(shù)字化八個(gè)隨機(jī)放置的圖像（總面積18 mm2）。使用我們實(shí)驗(yàn)室為Image Pro Plus軟件（v.7.0）開發(fā)的腳本計(jì)數(shù)每個(gè)圖像中的細(xì)胞數(shù)。
為了確定纖毛蟲密度，將250μL開放水樣品與10μL盧戈氏溶液混合，然后注入玻璃比色皿（深度2.34 mm）中，以便纖毛蟲細(xì)胞可以立即染色和固定。對(duì)于每個(gè)樣品，使用奧林巴斯SZX顯微鏡（32倍放大）數(shù)字化八個(gè)隨機(jī)放置的圖像（總面積18 mm2）。使用Image Pro Plus腳本計(jì)數(shù)每個(gè)圖像中的細(xì)胞數(shù)。
用噬菌體Semad11和細(xì)菌Db11進(jìn)行的短期實(shí)驗(yàn)
將Db11在25°C的LB平板上培養(yǎng)48小時(shí)，將單個(gè)菌落接種到NAS培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)物在搖床（120 rpm）中于25°C培養(yǎng)48小時(shí)。將5微升細(xì)菌培養(yǎng)物接種到含有400μL NAS培養(yǎng)基的蜂窩板2（Oy Growth Curves Ab Ltd）的200個(gè)孔中。同時(shí)，向100個(gè)孔中加入5微升含有約10^4 PFU的噬菌體儲(chǔ)備液（溶于dH2O中）。使用Bioscreen C分光光度計(jì)（Oy Growth Curves Ab Ltd）在460-580 nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD。測(cè)量以5分鐘為間隔重復(fù)進(jìn)行100小時(shí)。在測(cè)量結(jié)束時(shí)，從噬菌體處理的孔中確認(rèn)了具有感染性的Semad11（使用祖先Db11）的存在。
統(tǒng)計(jì)分析
除了細(xì)菌的開放水和壁生物量以及原生動(dòng)物密度外，我們還計(jì)算了開放水與生物膜生物量的比率以及系統(tǒng)中的總細(xì)菌生物量。這些響應(yīng)變量在每周的取樣中測(cè)量，每次取樣為每個(gè)處理選擇四個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行破壞性取樣。因此，我們使用ANOVA，其中時(shí)間和群落組合被視為因素（響應(yīng)變量=群落+時(shí)間+群落x時(shí)間+誤差）。需要時(shí)，對(duì)響應(yīng)變量進(jìn)行平方根或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換以滿足分析假設(shè)。
使用Friedman檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)比較不同細(xì)菌敵害和敵害組合在減少開放水和生物膜中細(xì)菌生物量方面的效率（樣本量在所有比較中均為4）。
表1.Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)顯示不同敵害組合在減少生物膜和開放水中細(xì)菌生長(zhǎng)方面的效率。
所有分析均使用SPSS v.19（IBM New York,NY,USA.）完成。
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