摘要
在革蘭氏陰性菌中，多藥外排泵負(fù)責(zé)排出對生長有害的化學(xué)物質(zhì)。部分外排泵由內(nèi)源性效應(yīng)物誘導(dǎo)，另一些則受非生物或生物信號調(diào)控表達(dá)。在惡臭假單胞菌中，TtgABC外排泵是主要的抗生素排出系統(tǒng)，通過TtgR介導(dǎo)的操縱子表達(dá)調(diào)控響應(yīng)外源性抗生素。質(zhì)粒編碼的TtgGHI外排泵在親本菌株的抗生素耐藥性中作用較弱，但在TtgABC缺陷的同基因背景中至關(guān)重要。ttgGHI的表達(dá)受TtgV調(diào)節(jié)子抑制，該調(diào)節(jié)子可將吲哚識別為效應(yīng)物，而惡臭假單胞菌自身不產(chǎn)生吲哚。由于假單胞菌不合成吲哚，這種吲哚依賴性抗生素耐藥性似乎是微生物群落水平耐藥機(jī)制的一部分。惡臭假單胞菌能夠識別培養(yǎng)基中添加的吲哚或混合微生物群落中大腸桿菌產(chǎn)生的吲哚。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，吲哚特異性響應(yīng)涉及43個(gè)基因的激活和23個(gè)基因的抑制。吲哚不僅增強(qiáng)TtgGHI泵的表達(dá)，還上調(diào)與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因以及氨基酸分解代謝基因。在TtgABC缺陷的惡臭假單胞菌中，氨芐西林等殺菌化合物會導(dǎo)致細(xì)胞死亡；而大腸桿菌與惡臭假單胞菌ΔttgABC共培養(yǎng)時(shí)，吲哚依賴性外排泵的誘導(dǎo)可使該突變體在氨芐西林存在下存活。
引言
惡臭假單胞菌是一類廣泛存在的微生物，可在植物根際土壤中以及水生系統(tǒng)中以懸浮態(tài)或生物膜形式附著于生物和非生物表面。該物種在多種環(huán)境條件下的存活和增殖，依賴于其豐富的代謝活性以及對其他微生物產(chǎn)生的抗菌化合物的響應(yīng)能力。
惡臭假單胞菌DOT-T1E菌株分離自格拉納達(dá)污水處理廠，能夠在高濃度芳香族化合物等有機(jī)溶劑存在下生長。此后研究表明，該菌株對多種有毒化合物具有耐藥性，包括染料、重金屬以及多種殺菌抗生素（如氨芐西林、哌拉西林、諾氟沙星）和抑菌抗生素（如氯霉素、四環(huán)素、紅霉素）。該微生物對殺菌和抑菌抗生素的主要耐藥機(jī)制，是通過耐藥性-結(jié)節(jié)形成-細(xì)胞分裂（RND）家族的多種多藥外排泵將抗生素排出細(xì)胞。已在惡臭假單胞菌DOT-T1E的基因組中鑒定出19個(gè)RND外排泵，其中兩個(gè)已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)參與抗生素排出：其一為TtgABC（T1E_0241-0243），位于染色體上，被認(rèn)為是該菌株中與抗生素耐藥性最相關(guān)的外排泵；另一個(gè)是質(zhì)粒編碼的TtgGHI，其在有機(jī)溶劑排出中更為重要。
TtgABC泵的表達(dá)具有基礎(chǔ)水平，且受TetR家族的TtgR調(diào)節(jié)子調(diào)控，可響應(yīng)特定抗生素和黃酮類化合物。TtgGHI外排泵的表達(dá)受IclR家族的抑制子TtgV調(diào)控，該抑制子不將抗生素識別為效應(yīng)物，而是識別吲哚——一種假單胞菌不合成的分子，且已被證實(shí)是TtgV的高效效應(yīng)物。
吲哚被認(rèn)為是一種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號分子。我們推測這兩種外排泵在抗生素耐藥性中發(fā)揮不同作用：TtgABC屬于單細(xì)胞水平的自身耐藥機(jī)制，而吲哚誘導(dǎo)的TtgGHI則屬于群落水平的耐藥機(jī)制。在腸桿菌中，色氨酸通過色氨酸酶作用產(chǎn)生吲哚，該過程不被細(xì)胞代謝，而是分泌到胞外培養(yǎng)基中，濃度可達(dá)0.5 mM。胞外吲哚可被大腸桿菌細(xì)胞攝取，并參與調(diào)控多種過程，如耐藥性、質(zhì)粒穩(wěn)定性、某些致病菌的毒力特征以及生物膜形成，因此吲哚可作為種內(nèi)信號分子。此外，吲哚也可被非腸桿菌攝取，并影響多種表型，例如抑制黑曲霉生長、增強(qiáng)腸炎沙門氏菌的耐藥性、促進(jìn)銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和烏納馬伯克霍爾德菌的生物膜形成，還可減弱銅綠假單胞菌的毒力，因此吲哚也是一種種間信號分子。
本研究探討了不同同基因惡臭假單胞菌菌株在有無吲哚存在時(shí)，對殺菌和抑菌抗生素的響應(yīng)；以惡臭假單胞菌為模型系統(tǒng)，明確了吲哚作為種間信號的作用。吲哚可影響惡臭假單胞菌中至少76個(gè)基因的表達(dá)模式，這些基因涉及細(xì)胞代謝、細(xì)胞壁生物合成和應(yīng)激防御，結(jié)果支持吲哚在惡臭假單胞菌中作為信號分子的功能。本研究證實(shí)，腸桿菌產(chǎn)生的吲哚可通過誘導(dǎo)TtgGHI外排泵并促進(jìn)抗生素排出，使假單胞菌在藥物存在下存活。
實(shí)驗(yàn)方法
菌株與培養(yǎng)條件
細(xì)菌細(xì)胞在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，惡臭假單胞菌培養(yǎng)溫度為30°C，大腸桿菌為37°C，在搖床中以200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。必要時(shí)添加適當(dāng)抗生素，終濃度如下：卡那霉素50μg/mL、利福平20μg/mL；本研究中使用的其他抗生素濃度見正文。
氨芐西林存在下大腸桿菌與惡臭假單胞菌的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
在該系列實(shí)驗(yàn)中，將不同細(xì)胞接種到20 mL LB培養(yǎng)基中，在無抗生素條件下單獨(dú)培養(yǎng)12-14小時(shí)；用無菌LB肉湯將這些培養(yǎng)物的濁度調(diào)整至660 nm處吸光度為0.1（約1±0.1×10^5 CFU/mL），然后將10 mL大腸桿菌細(xì)胞與10 mL惡臭假單胞菌DOT-T1E或惡臭假單胞菌T1E-18混合；以各菌株單獨(dú)培養(yǎng)作為對照。如正文所述，向所有培養(yǎng)物中添加氨芐西林（300μg/mL），隨后在30°C振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取樣，系列稀釋后涂布到選擇性培養(yǎng)基上：添加20μg/mL利福平的固體LB培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)惡臭假單胞菌DOT-T1E；添加利福平和卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)T1E-18；添加50μg/mL鏈霉素和100μg/mL氨芐西林的固體LB培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)大腸桿菌K111。在30°C培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)數(shù)菌落，推算CFU/mL；每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。
最低抑菌濃度（MIC）測定
根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會的指南，采用兩倍系列稀釋法在含或不含300μM吲哚的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行MIC測定。使用的抗生素最高濃度如下：四環(huán)素10,000μg/mL、氯霉素3000μg/mL、諾氟沙星200μg/mL、紅霉素3000μg/mL和氨芐西林10,000μg/mL。每個(gè)測定至少進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)；MIC定義為抑制菌株生長的最低抗生素濃度。
紙片擴(kuò)散法抗生素敏感性測試
采用柯比-鮑爾法：在含或不含300μM吲哚的LB瓊脂平板上，涂布約10^8 CFU/mL的野生型惡臭假單胞菌DOT-T1E或其突變體菌株（惡臭假單胞菌T1E-18、T1E-PS28和T1E-PS32），形成菌苔；平板表面干燥后，將氧氟沙星（5μg）、培氟沙星（5μg）、阿莫西林（25μg）、替卡西林（75μg）、氨芐西林（10μg）、頭孢他啶（30μg）、氯霉素（30μg）、紅霉素（15μg）和四環(huán)素（30μg）的抗生素紙片放置在平板表面；在30°C培養(yǎng)18-20小時(shí)后，測量每個(gè)紙片周圍的抑菌圈直徑（mm）。在以大腸桿菌上清液作為吲哚來源的系列實(shí)驗(yàn)中，將100 mL過濾后的培養(yǎng)上清液與50 mL 5%LB瓊脂混合并鋪板，實(shí)驗(yàn)方法與添加純吲哚時(shí)相同。
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