摘要
鼠疫耶爾森菌作為假結(jié)核耶爾森菌的一個(gè)克隆變體進(jìn)化而來(lái)，通過(guò)跳蚤傳播的、生物膜介導(dǎo)的方式引發(fā)腺鼠疫。LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RovM僅在鼠疫耶爾森菌感染跳蚤宿主期間被高度誘導(dǎo)。RovM在其他病原體中的同源物調(diào)節(jié)生物膜形成、營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)和毒力；包括在假結(jié)核耶爾森菌中，RovM抑制主要毒力因子RovA。本研究通過(guò)使用缺失rovM的鼠疫耶爾森菌KIM6+菌株（ΔrovM）來(lái)調(diào)查RovM在跳蚤感染期間的作用。ΔrovM突變株在跳蚤單一感染中，其特有的生物膜腸道阻塞、生長(zhǎng)或存活未受影響。
然而，在跳蚤共感染期間，與野生型菌株相比，ΔrovM突變株表現(xiàn)出顯著的競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)性缺陷。這種競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)性缺陷在反式互補(bǔ)并過(guò)表達(dá)rovM的ΔrovM突變株中，相對(duì)于野生型恢復(fù)為適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)。與此一致的是，與野生型相比，產(chǎn)生更高RovM轉(zhuǎn)錄水平的鼠疫耶爾森菌菌株在響應(yīng)特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)表現(xiàn)出更高的生長(zhǎng)速率和差異化的生物膜形成能力。此外，我們證明在跳蚤體內(nèi)rovA并未被RovM抑制，但在體外，rovM轉(zhuǎn)錄水平升高與特定營(yíng)養(yǎng)條件下rovA的抑制相關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明RovM很可能感知跳蚤腸道環(huán)境中的特定營(yíng)養(yǎng)線索，并相應(yīng)地指導(dǎo)代謝適應(yīng)以增強(qiáng)鼠疫耶爾森菌對(duì)跳蚤腸道的定植。
引言
引起腺鼠疫的桿菌——鼠疫耶爾森菌，可以通過(guò)在其跳蚤媒介的前胃形成堅(jiān)固的生物膜而有效地傳播給哺乳動(dòng)物宿主。為了理解指導(dǎo)跳蚤體內(nèi)生物膜阻塞的分子機(jī)制，先前已經(jīng)對(duì)來(lái)自阻塞跳蚤的鼠疫耶爾森菌與在溫度匹配的體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的鼠疫耶爾森菌的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行了表征。觀察到編碼LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（LTTR）的rovM基因僅在跳蚤腸道中被高度上調(diào)。
LTTRs在原核生物中構(gòu)成一個(gè)龐大的家族，調(diào)節(jié)涉及毒力、代謝、運(yùn)動(dòng)和群體感應(yīng)的多種基因。鼠疫耶爾森菌的RovM蛋白與同源LTTRs（LrhA/HexS/PecT/HexA）共享超過(guò)65%的整體同一性，這些同源物在致病性大腸桿菌、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬以及昆蟲(chóng)病原體發(fā)光光桿菌和嗜線蟲(chóng)致病桿菌中調(diào)節(jié)生物膜形成、粘附素合成、胞外多糖、運(yùn)動(dòng)性、胞外酶和胞外脂質(zhì)等基本毒力因子。然而，與昆蟲(chóng)病原體發(fā)光光桿菌和嗜線蟲(chóng)致病桿菌不同，鼠疫耶爾森菌對(duì)跳蚤無(wú)毒力。
Heroven等人確定，假結(jié)核耶爾森菌的RovM轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子響應(yīng)特定的環(huán)境營(yíng)養(yǎng)線索，是一個(gè)關(guān)鍵的毒力調(diào)節(jié)因子，其蛋白水平升高會(huì)導(dǎo)致小鼠感染期間運(yùn)動(dòng)過(guò)度且無(wú)法傳播到更深層組織。重要的是，假結(jié)核耶爾森菌的RovM能夠調(diào)節(jié)rovA的活性，rovA編碼另一個(gè)主要的毒力轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，間接控制腸道組織中的細(xì)胞侵襲。RovM蛋白能夠在基本培養(yǎng)基中抑制rovA，這是通過(guò)全局代謝調(diào)節(jié)蛋白CsrA及其相關(guān)的調(diào)節(jié)性非編碼RNA介導(dǎo)的。總的來(lái)說(shuō)，RovA在調(diào)節(jié)毒力方面的作用已在假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和鼠疫耶爾森菌中得到明確界定。特別是在鼠疫耶爾森菌中，已證明RovA激活pH6抗原位點(diǎn)（psaEFABC），該位點(diǎn)負(fù)責(zé)合成和運(yùn)輸PsaA菌毛，以增強(qiáng)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的抵抗力；并且RovA和PsaA在鼠疫腺鼠疫小鼠模型中都是完全毒力所必需的。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，rovM在跳蚤體內(nèi)的上調(diào)伴隨著rovA和psaE的顯著下調(diào)。相反，在腺鼠疫期間，rovA上調(diào)超過(guò)5倍，而rovM下調(diào)。
鑒于RovM及其同源物在細(xì)菌致病性中的重要性，我們預(yù)測(cè)鼠疫耶爾森菌的RovM在調(diào)節(jié)生物膜形成、抑制rovA和/或其哺乳動(dòng)物毒力調(diào)節(jié)子、和/或營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)以增強(qiáng)鼠疫耶爾森菌對(duì)跳蚤宿主的感染方面具有保守作用。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們構(gòu)建了鼠疫耶爾森菌KIM6+ΔrovM突變體，并在體外通過(guò)評(píng)估其生長(zhǎng)、生物膜形成以及rovM和rovA轉(zhuǎn)錄的測(cè)定，以及在跳蚤腸道感染期間體內(nèi)評(píng)估其生物膜介導(dǎo)的腸道阻塞和存活能力來(lái)表征其作用。我們的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RovM可以響應(yīng)特定的營(yíng)養(yǎng)線索（例如精氨酸）調(diào)節(jié)生物膜，但并不控制跳蚤腸道中rovA的表達(dá)。重要的是，RovM的表達(dá)似乎與營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)和獲取相關(guān)，并且對(duì)于鼠疫耶爾森菌有效適應(yīng)跳蚤腸道環(huán)境至關(guān)重要。
材料與方法
細(xì)菌菌株、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件
本研究中使用的細(xì)菌菌株是鼠疫耶爾森菌KIM6+，該菌株缺乏編碼T3SS的70-kb毒力質(zhì)粒。所有生長(zhǎng)研究均在約23°C下使用Bioscreen C搖床培養(yǎng)箱進(jìn)行，并在所選研究培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)的條件化生長(zhǎng)步驟。在本研究中，除了豐富的復(fù)雜LB培養(yǎng)基外，還使用了兩種用于鼠疫耶爾森菌特定培養(yǎng)的化學(xué)限定培養(yǎng)基。一種是稱為T(mén)MH的復(fù)雜限定培養(yǎng)基，另一種是最低培養(yǎng)基，我們稱之為Sebbane最低培養(yǎng)基（SMM）。這兩種鼠疫耶爾森菌限定培養(yǎng)基都用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以向其中添加新的碳源或氮源。TMH培養(yǎng)基促進(jìn)鼠疫耶爾森菌的生物膜形成，并補(bǔ)充有0.2%半乳糖和1μg/mL血紅素。也使用了不含精氨酸（arg）的TMH培養(yǎng)基。為簡(jiǎn)化參考，我們將補(bǔ)充了0.2%半乳糖和1μg/mL血紅素、含或不含arg的TMH培養(yǎng)基分別稱為T(mén)MH-gal+或TMH-gal+arg。
SMM培養(yǎng)基包含鼠疫耶爾森菌生長(zhǎng)所需的基本代謝物，包括其營(yíng)養(yǎng)缺陷的五種氨基酸（異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸）。對(duì)于生長(zhǎng)研究以確定新?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)鼠疫耶爾森菌生長(zhǎng)的影響，將SMM培養(yǎng)基補(bǔ)充以濃度為0.2%（w/v）的糖類：葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖和N,N'-二乙酰殼二糖?；蛘撸瑢MM中通常不含的氨基酸：谷氨酰胺（gln）、精氨酸（arg）和組氨酸（his），按照它們?cè)赥MH培養(yǎng)基中的濃度（分別為100mM、24mM和2mM）補(bǔ)充到SMM中。生長(zhǎng)研究進(jìn)行了3-4次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。生長(zhǎng)速率使用指數(shù)生長(zhǎng)期的線性回歸分析計(jì)算。
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