討論
乳酸乳球菌IL1403的claR基因產物屬于RpiR家族的潛在調控因子，該家族成員在許多其他相關或遠緣細菌屬中大量存在（http://www.kegg.jp/kegg/ssdb/）。最強的ClaR直系同源物僅在其他乳酸球菌物種中發(fā)現(xiàn)（例如，乳酸乳球菌亞種cremoris MG1363和SK11，以及乳酸乳球菌亞種lactis KF147）。在乳酸乳球菌IL1403基因組中編碼了八個來自RpiR家族的旁系同源物（由yidA、yecA、yljC、yfeA、yugA、gntR和yleF編碼），其中ClaR是原型例子。迄今為止，尚未將功能分配給乳酸乳球菌中任何RpiR家族基因。
然而，在許多不同細菌物種中發(fā)現(xiàn)的ClaR直系同源物的保守性表明在宿主生物中具有重要作用。實際上，已顯示RpiR家族的少數(shù)成員作為參與不同碳源代謝的基因的正向或負向轉錄調控因子發(fā)揮作用。例如，在枯草芽孢桿菌中，麥芽糖代謝受到GlvR的正向調控。到目前為止，GlvR是革蘭氏陽性細菌組中表征的RpiR調控因子家族的唯一代表。所有其他功能表征的例子都來源于革蘭氏陰性細菌，其中RpiR家族調控因子似乎下調基因表達。這些RpiR樣阻遏物已被證明在大腸桿菌中調控核糖和N-乙酰muramic acid的代謝，在惡臭假單胞菌中調控葡萄糖代謝，以及在柄桿菌、腸道沙門氏菌和苜蓿中華根瘤菌中調控肌醇代謝。RpiR家族成員在其N端包含一個HTH基序，在其C端包含一個SIS結構域。SIS結構域是在許多調控磷酸糖合成基因表達的蛋白質中發(fā)現(xiàn)的磷酸糖結合結構域。
有理由推測這種類型的調控在乳酸乳球菌IL1403中起作用；理論上，通過CelB進入IL1403細胞后磷酸化的纖維二糖或乳糖與ClaR的SIS結構域結合。這種結合可能導致ClaR調控因子的刺激，并允許其結合到相應的DNA區(qū)域，從而導致ClaR依賴的基因表達調控。我們假設通過這種機制，在纖維二糖或乳糖存在下，可以激活bglS、celB和ptcBA的表達。證實這一假設的證據(jù)包括觀察到在纖維二糖存在下，claR突變體生長時，由于ClaR缺失，bglS、celB以及較小程度的ptcBA mRNA水平顯著降低（表2）。當半乳糖或葡萄糖作為唯一碳源存在時，未觀察到這種效應，表明這些糖對ClaR沒有激活作用。
此外，ClaR在乳糖和纖維二糖代謝中起作用的假設得到了claR突變體在纖維二糖和/或乳糖補充培養(yǎng)基中生長缺陷的有力證實（圖2a-c）。在IL1403△ccpA△claR菌株中缺失ccpA導致其在纖維二糖補充培養(yǎng)基中的生長部分恢復，但在乳糖補充培養(yǎng)基中則沒有（圖2a-c）。因此，可以合理地得出結論，由于缺乏bglS和celB的轉錄，這兩種突變體幾乎或完全不能利用這些糖，而bglS和celB的轉錄是PTSCel-Lac功能所必需的。
當通過表型微陣列和API 50CH測試進行全局評估時，在測試的數(shù)十種不同碳源中，未檢測到claR缺失菌株與親本菌株之間的進一步表型差異，這證實了ClaR的狹窄但顯著的特異性。IL1403△claR在纖維二糖上幾乎無法生長（圖2a），同時在該糖上能有效呼吸（當通過表型微陣列測試時），這種矛盾現(xiàn)象可以通過IL1403中纖維二糖代謝的命運來解釋。先前，我們表明EIIC CelB通透酶是乳酸乳球菌IL1403中纖維二糖和乳糖攝取的唯一專用蛋白，而BglS是乳糖水解的關鍵糖苷酶。盡管纖維二糖也是BglS的底物，但推測IL1403中可能存在一種或多種能夠水解這種糖的額外酶，并且可能受到CcpA介導的負調控。此外，本研究的結果清楚地表明，bglS的轉錄緊密依賴于ClaR的激活，而celB的轉錄在較小程度上依賴于ClaR的激活（表2）。因此，我們可以假設在IL1403△claR中，仍然存在少量CelB，可能轉運痕量的乳糖或纖維二糖。在IL1403△claR中內化的乳糖由于缺乏BglS（由ClaR缺失導致）不能作為能源。另一方面，在IL1403△claR中，通過CelB攝取纖維二糖以及不同于BglS的水解酶活性形成的纖維二糖衍生代謝物量很少，不足以進行有效的突變體細胞分裂，導致突變體生長受限。
本研究通過RT-qPCR確定的結果表明，在所有測試條件下（在不同糖存在下[表2]以及在CcpA蛋白存在或缺失下[數(shù)據(jù)未顯示]），claR均以低水平弱表達，其相對基因表達水平僅略高于零。這與許多轉錄調控因子內源性以低量存在的事實一致，就ClaR而言，這可能是由于幾個原因。首先，在claR基因上游發(fā)現(xiàn)的兩個推定啟動子與-10和-35序列的共有位點均顯示不完全相關性，因此可能驅動低水平轉錄。其次，這些推定啟動子之一產生的轉錄本起始于rho非依賴型終止子序列上游（圖1b，c），這可能過早終止claR轉錄。我們證明它是一個中等強度的終止子，因為它以約60%的效率阻止了claR的轉錄。因此，可以假設覆蓋claR基因的全長轉錄本的生成可能是通過少量通讀轉錄實現(xiàn)的。然而，我們不能排除未知抗終止因子影響下通讀終止效率可能增強的可能性。
盡管ClaR在糖代謝背景下的特異性狹窄，但其調控的基因在乳酸乳球菌菌株棲息的生態(tài)系統(tǒng)——植物材料（纖維二糖）和乳汁（乳糖）——中非常重要。擁有這樣的調控因子允許其定居更多樣化的環(huán)境，從而賦予乳酸乳球菌相對于其他微生物的優(yōu)勢。ClaR蛋白前所未有的作用使其更加重要，因為乳糖和β-葡萄糖苷的代謝對于涉及乳酸乳球菌的生物技術過程具有巨大的經濟重要性，涉及發(fā)酵乳制品和植物產品的生產。獲得與乳酸乳球菌中糖代謝及相關基因表達調控相關的詳細知識可能有助于改進控制這些細菌中重要細胞過程的機制。對于像乳酸乳球菌這樣的工業(yè)微生物，修改明確的調控網絡可能會 drastically 影響細菌的特性并對生物過程產生影響。最后，我們可以假設通過我們的研究，我們可以引入乳酸球菌菌株代謝潛力的變化，這些菌株本身不能同化乳糖。我們可以通過失活ccpA或通過添加纖維二糖激活其他基因來啟動這一過程。與質粒定位的lac操縱子相反，編碼PTSCel-Lac組分的基因位于染色體上，這確保了它們的穩(wěn)定性，這是工業(yè)應用的一個潛在重要特征。
相關新聞推薦
1、單細胞微生物生長時期精準鑒定與實時監(jiān)測方法（一）
2、基于矩陣種群模型量化溫度對原綠球藻（?海洋中最微小的生物之一）的非線性影響
3、不同麩皮、羽毛、料水配比條件下淡紫擬青霉、酵母菌的生長曲線（一）