摘要


鼠李糖乳桿菌是一種著名的乳酸菌，但最近首次從商業(yè)益生菌粉末中分離出新菌株ZY。盡管許多研究致力于開發(fā)成本效益高的培養(yǎng)基用于乳酸菌生產(chǎn)，但de Man、Rogosa和Sharpe（MRS）培養(yǎng)基仍然是生物過程中最常用的培養(yǎng)基。本研究旨在基于統(tǒng)計(jì)方法解析MRS的組成，以獲得更高的乳桿菌生物量。在田口方法中，采用L27正交陣列評(píng)估MRS中10種成分的顯著性，根據(jù)其對(duì)OD600生物量的影響排序?yàn)椋浩咸烟?> MnSO4·H2O > 牛肉浸膏 > CH3COONa > MgSO4 > 酵母浸膏 > 蛋白胨 > K2HPO4 > 檸檬酸銨 > Tween 80。盡管統(tǒng)計(jì)分析后MRS中檸檬酸銨、K2HPO4、CH3COONa和MgSO4等單個(gè)微量元素對(duì)生物量影響不顯著，但完全去除微量元素會(huì)顯著影響乳桿菌的細(xì)胞生長。通過衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）和SDS-PAGE結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定進(jìn)一步表征細(xì)胞特性，表明MRS中作為主要碳源的葡萄糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的生產(chǎn)起著最關(guān)鍵的作用。


引言


益生菌被世界衛(wèi)生組織（WHO）定義為“當(dāng)攝入足夠量時(shí)，對(duì)宿主健康有益的活微生物”。大多數(shù)益生菌包括乳酸菌，主要選自乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，它們是健康促進(jìn)細(xì)菌，構(gòu)成平衡腸道微生物群的主要部分。供人類消費(fèi)的乳酸菌主要存在于發(fā)酵乳、奶酪、果汁、葡萄酒和香腸中。益生菌或乳酸菌通過多種機(jī)制發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)參與小腸黏膜免疫反應(yīng)、炎癥和凋亡的人類基因表達(dá)，以及肥大細(xì)胞中過敏相關(guān)激活。此外，許多分子被認(rèn)為參與宿主信號(hào)傳導(dǎo)，如分泌蛋白、細(xì)胞壁成分或從細(xì)胞包膜突出的菌毛。


通常，乳酸菌具有多種氨基酸和維生素營養(yǎng)缺陷。據(jù)信，為乳酸菌開發(fā)豐富復(fù)雜的培養(yǎng)基將導(dǎo)致選擇與其生物位點(diǎn)密切相關(guān)的特定營養(yǎng)缺陷。著名的乳酸菌乳桿菌可在多種復(fù)雜培養(yǎng)基中發(fā)酵，包括植物材料和液體培養(yǎng)基如MRS培養(yǎng)基，或在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（CDM）中。其中，MRS培養(yǎng)基在乳桿菌培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛。盡管許多研究人員證明乳桿菌在MRS中生長良好，但尚未有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)估MRS中10種特定成分對(duì)細(xì)胞生長、蛋白質(zhì)和其他因素的影響。先前研究表明，發(fā)酵特性（包括生長培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度和pH）影響生物量產(chǎn)量以及乳桿菌的表面特性。然而，關(guān)于MRS成分對(duì)益生乳桿菌生產(chǎn)過程和行為影響的知識(shí)有限。


傳統(tǒng)上，發(fā)酵過程使用一次一因素策略進(jìn)行優(yōu)化。這種方法相對(duì)簡單，不需要繁瑣耗時(shí)的統(tǒng)計(jì)分析；然而，該策略無法分析兩個(gè)或多個(gè)因素之間發(fā)生的相互作用。為消除這些缺點(diǎn)，田口方法被應(yīng)用于確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳參數(shù)，因?yàn)樗鼉H使用實(shí)驗(yàn)可能因素組合的一小部分，并顯示出令人滿意的結(jié)果。


在本研究中，從商業(yè)益生菌產(chǎn)品中分離出一株乳酸菌。通過基于16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定，該菌株被歸類為鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus ZY）。由于已知培養(yǎng)基組成是發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)合適的發(fā)酵培養(yǎng)基是提高產(chǎn)物產(chǎn)量的有效方法。據(jù)我們所知，目前尚無關(guān)于MRS培養(yǎng)基成分對(duì)乳桿菌發(fā)酵影響的報(bào)告。這是首次嘗試建立正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（L27）以篩選顯著變量，隨后使用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得MRS培養(yǎng)基的最佳組成。此外，為考慮生長、蛋白質(zhì)和益生能力之間可能的相關(guān)性，進(jìn)行SDS-PAGE分析和FTIR以更好地理解影響鼠李糖乳桿菌生長的MRS培養(yǎng)基成分。


材料與方法


益生菌的分離與鑒定


通過16S rRNA測序方法使用通用引物27f和1525r分析分離菌株的鑒定。從臺(tái)灣商業(yè)益生菌膠囊中分離出一株細(xì)菌菌株，命名為鼠李糖乳桿菌ZY。該菌株的16S rRNA序列已存入GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為KC012630。


菌株和培養(yǎng)條件


儲(chǔ)備培養(yǎng)物保存在4°C的MRS瓊脂平板上，每月轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基。為制備接種物，將MRS瓊脂上的培養(yǎng)物在MRS肉湯（g/L）中傳代培養(yǎng)12小時(shí)，溫度為37°C：葡萄糖20，酵母浸膏5，KH2PO4 2，乙酸鈉5，MgSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.05，檸檬酸銨2，牛肉浸膏10，蛋白胨10，葡萄糖1。


細(xì)菌生長監(jiān)測


使用Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀和微孔板監(jiān)測細(xì)胞密度。在600 nm波長下讀取光密度（OD）。將接種培養(yǎng)基以350μl體積無菌分配至蜂窩微孔板（10 x 10）中，并將等體積未接種培養(yǎng)基無菌分配至微孔板中作為對(duì)照以確定可能污染。微孔板立即在Bioscreen C系統(tǒng)中于37°C孵育25小時(shí)。時(shí)間進(jìn)程每30分鐘在線監(jiān)測一次。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。


生長動(dòng)力學(xué)分析


根據(jù)Zwietering等人修改的Gompertz方程對(duì)生長數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，形式為γ=k+A exp{-exp[(μmax e/A)(λ-t)+1]}；其中γ是時(shí)間t時(shí)的生長程度，以log CFU/mL表示；k是初始細(xì)胞密度，以log CFU/mL表示；A表示接種和穩(wěn)定期之間細(xì)胞密度的差異；μmax是最大生長速率，以△log CFU/mL/h表示；λ是以小時(shí)表示的潛伏期長度，t是時(shí)間。通過SigmaPlot 10.0的非線性回歸程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模。

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