摘要:里約熱內(nèi)盧大都會(huì)區(qū)是貓相關(guān)孢子絲菌病的高度流行區(qū)。本研究旨在評(píng)估一例慢性、破壞性播散性孢子絲菌病患者體內(nèi)連續(xù)分離的孢子絲菌分離株的毒力。在五年期間，從皮膚滲出物和骨骼樣本中培養(yǎng)了五株孢子絲菌分離株，經(jīng)分子鑒定均為巴西利亞孢子絲菌。與大蠟螟幼蟲(chóng)中的早期分離株相比，最終的分離株表現(xiàn)出顯著更高的毒力。我們得出結(jié)論，巴西利亞孢子絲菌具有在體內(nèi)增強(qiáng)毒力的能力。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于護(hù)理巴西利亞孢子絲菌病患者的臨床醫(yī)生具有重要意義，并表明需要進(jìn)一步研究以確定慢性疾病期間致病性增強(qiáng)的潛在機(jī)制。
引言
孢子絲菌病是一種由孢子絲菌復(fù)合體引起的皮下真菌病。分子研究已鑒定出巴西利亞孢子絲菌、球形孢子絲菌、盧里孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌、淺白孢子絲菌和申克孢子絲菌（全球最常見(jiàn)的物種）是不同地區(qū)孢子絲菌病的病原體。
里約熱內(nèi)盧大都會(huì)區(qū)是貓相關(guān)孢子絲菌病的高度流行區(qū)，主要病原體是巴西利亞孢子絲菌。巴西利亞孢子絲菌患者表現(xiàn)為急性、慢性、固定型、淋巴管型、黏膜型、播散型和復(fù)發(fā)性孢子絲菌病，以及超敏反應(yīng)表現(xiàn)。在非免疫抑制患者中播散性病例比其他地區(qū)和其他物種先前報(bào)道的更常見(jiàn)，這可能與受感染貓的多次深度抓傷導(dǎo)致組織中的高接種量有關(guān)，也與巴西利亞孢子絲菌相對(duì)于其他孢子絲菌物種具有更強(qiáng)的毒力有關(guān)。
除了接種量之外，促進(jìn)巴西利亞孢子絲菌導(dǎo)致頻繁和嚴(yán)重疾病的候選因素包括耐熱性、酶和其他分子的產(chǎn)生、對(duì)氧化應(yīng)激和抗真菌藥物的耐藥性。目前，關(guān)于巴西利亞孢子絲菌毒力的信息有限。本研究的目的是描述從一例慢性、破壞性播散性孢子絲菌病患者體內(nèi)連續(xù)分離的孢子絲菌分離株毒力增強(qiáng)的演變過(guò)程。
病例報(bào)告
一名61歲的退休砌磚工，患有糖尿病和高血壓，因6年皮膚病變病史被轉(zhuǎn)診至里約熱內(nèi)盧Evandro Chagas國(guó)家傳染病研究所傳染病皮膚病學(xué)實(shí)驗(yàn)室。初步診斷后，他接受了5個(gè)月的碘化鉀治療，皮膚病變愈合。然而，他主訴膝蓋和左腕關(guān)節(jié)疼痛逐漸加重，至轉(zhuǎn)診至INI前兩年需坐輪椅。轉(zhuǎn)診至INI前6個(gè)月，他注意到皮膚病變復(fù)發(fā)。
在我們初次檢查時(shí)，患者四肢有多處疤痕，左腕背側(cè)有一個(gè)滲出性小潰瘍病變和一個(gè)囊性病變（圖1A-B）。雙膝和左腕關(guān)節(jié)強(qiáng)直。X光片顯示這些關(guān)節(jié)處有溶骨性病變和硬化（圖1C-D）。人類免疫缺陷病毒和人類T淋巴細(xì)胞病毒檢測(cè)為陰性。總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為1,470/μL，T CD4+計(jì)數(shù)為554/μL，均正常。初始T細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)?shù)停?4/μL）。從左腕部皮膚病變培養(yǎng)出孢子絲菌屬，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行的孢子絲菌病抗體檢測(cè)為陽(yáng)性（OD:2.548/Cut-Off:0.605）。
由于他常規(guī)藥物（卡托普利、氫氯噻嗪和格列本脲）與伊曲康唑存在潛在有害相互作用，他接受了特比萘芬500 mg/天治療32個(gè)月，直至皮膚病變愈合且影像學(xué)模式穩(wěn)定。然而，由于11個(gè)月后皮膚病變復(fù)發(fā)，特比萘芬重新開(kāi)始使用，并且由于疾病的頑固、復(fù)發(fā)性質(zhì)，他目前繼續(xù)接受這種抗真菌治療。由于雙膝和左腕嚴(yán)重、永久性畸形（經(jīng)磁共振證實(shí)），他仍需坐輪椅。在他的病程中，從左前臂和左膝采集了皮膚樣本，以及從左股骨采集了活檢樣本。
材料與方法
倫理聲明
INI/Fiocruz,RJ,Brazil的研究倫理委員會(huì)根據(jù)協(xié)議編號(hào)0024.0.009.000-10批準(zhǔn)了本研究。
臨床標(biāo)本
在5年期間從患者的病變處采集了五份生物標(biāo)本。前3份樣本（IPEC32742,IPEC33070和IPEC33718，下文分別稱為"1"、"2"和"3"）于2007年9月至2008年3月期間通過(guò)細(xì)針無(wú)菌穿刺從左腕部囊性病變采集；第四份樣本（IPEC33946，隨后稱為"4"）來(lái)自2008年4月的左股骨活檢；第五份樣本（IPEC43174，下文稱為"5"）來(lái)自2012年2月左膝上皮膚的潰瘍性結(jié)節(jié)。分離株儲(chǔ)存在-20°C冰箱中含有10%脫脂奶的凍存管中。
孢子絲菌病診斷
所有臨床標(biāo)本均進(jìn)行常規(guī)真菌學(xué)檢查，包括10%KOH濕片直接鏡檢和在2%沙氏葡萄糖瓊脂和Mycobiotic瓊脂上培養(yǎng)。培養(yǎng)物在25°C下孵育，觀察4周是否有真菌生長(zhǎng)。通過(guò)在37°C的腦心浸液瓊脂上培養(yǎng)7天轉(zhuǎn)化為酵母樣形式來(lái)證明雙相性。
分子鑒定
使用氯仿/異戊醇方法從分離株的酵母相提取基因組DNA，用于部分β-微管蛋白和幾丁質(zhì)合成酶編碼基因的測(cè)序，以及如所述進(jìn)行T3B PCR指紋圖譜分析。在T3B PCR指紋圖譜中，對(duì)照菌株為巴西利亞孢子絲菌(CBS120339)、墨西哥孢子絲菌(MUM11.02)、申克孢子絲菌(ATCC32286)和球形孢子絲菌(IPEC27135)。在測(cè)序分析中，使用巴西利亞孢子絲菌(CBS120339)、球形孢子絲菌(FMR8600)、墨西哥孢子絲菌(CBS120341)、淺白孢子絲菌(CBS111110)和申克孢子絲菌(FMR8604)作為NCBI公共Genbank的參考菌株。
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