2.材料與方法
2.1.微生物
選擇蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌作為產(chǎn)芽孢革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的代表微生物。
蠟樣芽孢桿菌INRA-AVTZ415由法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)研究所（INRA,Avignon）kindly提供。單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌型菌株（分別為CECT 4031和CECT 515）由西班牙型菌種保藏中心（CECT）提供。
為了接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，蠟樣芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在30°C下在腦心浸液肉湯（BHI;Scharlau Chemie S.A.,Barcelona,Spain）中培養(yǎng)，直至達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。單核細(xì)胞增生李斯特菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在37°C下在補(bǔ)充了0.6%酵母提取物（YE;Scharlau Chemie）的胰蛋白酶大豆肉湯（TSB;Scharlau Chemie）中培養(yǎng)，直至達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在37°C下在酸化至pH 5 with HCl（Panreac Química,Barcelona,Spain）的TSB+YE中培養(yǎng)，直至達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。選擇這些生長(zhǎng)條件作為這些微生物的有利條件。
2.2.光密度生長(zhǎng)曲線
100孔微孔板填充400μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基（蠟樣芽孢桿菌用BHI，單核細(xì)胞增生李斯特菌用TSB+YE，大腸桿菌用pH 5 TSB+YE），接種微生物并在Bioscreen C分析儀（Oy Growth Curves Ab Ltd.,Helsinki,Finland）中培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的初始濃度對(duì)于蠟樣芽孢桿菌為101,102,103,10?,10?和10?CFU mL?1，對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特菌為10°,10°,10°,10°,10°和10°CFU mL?1，對(duì)于大腸桿菌為102,10?和10?CFU mL?1。為了避免不同培養(yǎng)物生理狀態(tài)差異引起的變異性，每種細(xì)菌的所有生長(zhǎng)曲線均來自單一細(xì)菌培養(yǎng)物。生長(zhǎng)培養(yǎng)基在30°C下培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌，在37°C下培養(yǎng)單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌。每20分鐘間隔，使用寬帶濾波器（420-580 nm）測(cè)量樣品的光密度（OD）。
對(duì)于每種微生物和初始濃度的組合，進(jìn)行了25-30次重復(fù)，除了蠟樣芽孢桿菌101和102CFU mL?1初始濃度，分別進(jìn)行了13和21次重復(fù)，以及單核細(xì)胞增生李斯特菌10°,10°和10°CFU mL?1初始濃度，各進(jìn)行了5次重復(fù)。通過繪制OD對(duì)暴露時(shí)間的圖獲得生長(zhǎng)曲線。通過吸光度測(cè)量生成了總共345條個(gè)體生長(zhǎng)曲線。
2.3.平板計(jì)數(shù)生長(zhǎng)曲線
50mL錐形瓶中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種微生物并在500 rpm振蕩下培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度與光密度生長(zhǎng)曲線使用的相同。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的初始濃度對(duì)于蠟樣芽孢桿菌為101,103和10°CFU mL?1，對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌為102,10?和10?CFU mL?1。在預(yù)設(shè)時(shí)間間隔，取樣，在緩沖蛋白胨水（BPW,Scharlau Chemie）中適當(dāng)稀釋，并在BHI瓊脂（BHIA,Scharlau Chemie）中于30°C培養(yǎng)24小時(shí)用于蠟樣芽孢桿菌，在胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA,Scharlau Chemie）+YE中于37°C培養(yǎng)24小時(shí)用于單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌。生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了重復(fù)。
通過繪制log CFU mL?1對(duì)暴露時(shí)間的圖獲得生長(zhǎng)曲線。
2.4.數(shù)學(xué)模型
使用五種初級(jí)生長(zhǎng)模型分析生長(zhǎng)曲線。這些生長(zhǎng)模型基于線性（源自Monod模型）或非線性（Gompertz、Logistic、Richards和Baranyi）方程（表1），并重新參數(shù)化以反映Zwietering等[3]推導(dǎo)的微生物生長(zhǎng)參數(shù)。
三相線性、Gompertz、logistic和Richards模型的曲線擬合使用Matlab 7.0（Math Works,Natick,USA）的曲線擬合工具進(jìn)行，計(jì)算了生長(zhǎng)參數(shù)的95%置信限（CL）以及擬合的r2、RMSE和平方和誤差（SSE）。
Baranyi方程的曲線擬合使用DMFit 2.0程序進(jìn)行，并使用了Baranyi和Roberts[23]的模型，由József Baranyi博士kindly提供。該程序提供了每個(gè)生長(zhǎng)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差以及擬合的r2和標(biāo)準(zhǔn)誤差。利用這些值，計(jì)算了生長(zhǎng)參數(shù)的95%CL和擬合的RMSE。
使用StatGraphics（StatPoint Technologies,Warrenton,USA）進(jìn)行方差分析、中位數(shù)和箱線圖四分位數(shù)計(jì)算。p值始終低于0.05。
表1：初級(jí)生長(zhǎng)模型。
a y：時(shí)間t時(shí)的對(duì)數(shù)計(jì)數(shù)或吸光度；y0：初始對(duì)數(shù)計(jì)數(shù)或吸光度；μ：最大生長(zhǎng)率；λ：延遲時(shí)間；t?：達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)階段的時(shí)間；ymax：最終對(duì)數(shù)計(jì)數(shù)或吸光度；C：從y0到y(tǒng)max的對(duì)數(shù)計(jì)數(shù)或吸光度增加；β：模型系數(shù)。
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