微生物
細(xì)菌
使用Escherichia coli（大腸桿菌）ATCC 25922、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）ATCC 9027和Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）ATCC 25923。所有培養(yǎng)物在含有20%甘油的胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中于-70°C保存，并在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)以獲得亞培養(yǎng)物，隨后將亞培養(yǎng)物接種于胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）上，于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。工作培養(yǎng)物由亞培養(yǎng)物在Mueller-Hinton肉湯中于37°C培養(yǎng)4小時(shí)制備，并使用0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)（Biomérieux Inc.）調(diào)整至1.5x10^8 CFU/ml的濃度。
真菌
Candida albicans（白色念珠菌）CMPUJH022在含有20%甘油的Oxoid麥芽提取肉湯（英國(guó)Basingstoke,Hampshire）中于-70°C保存，并在麥芽提取物中于37°C培養(yǎng)24小時(shí)以獲得亞培養(yǎng)物，隨后將亞培養(yǎng)物接種于Sabouraud瓊脂（Merck，德國(guó)）上，于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。工作培養(yǎng)物由亞培養(yǎng)物在Sabouraud瓊脂上于37°C培養(yǎng)4小時(shí)制備，并使用0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)（Biomérieux Inc.，法國(guó)Craponne）調(diào)整至1.5x10^8 CFU/ml的濃度。
Aspergillus niger（黑曲霉）ATCC 16404在Sabouraud瓊脂上于25°C培養(yǎng)5天。使用2毫升無菌生理鹽水從該培養(yǎng)物中回收分生孢子，并分裝成100微升以備后用。為獲得單孢子培養(yǎng)物，將100μl分生孢子溶液大量接種于Sabouraud瓊脂上，然后，將濾紙片（5毫米）置于瓊脂上，并在25°C下培養(yǎng)5天。
氣相色譜法(GC-FID)
精油的氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器（GC-FID）分析在3900氣相色譜儀（Varian，荷蘭）上進(jìn)行，配備火焰離子化檢測(cè)器。使用的色譜柱是Elite 5 MS柱（30 m x 0.25 mm x 0.25μm）（Perkin Elmer，荷蘭）。使用氦氣作為載氣，流速為1mL/min。柱溫箱程序初始為50°C保持2分鐘，以4°C/min的速率升至160°C保持5分鐘，以8°C/min的速率升至220°C保持2分鐘，以15°C/min的速率升至280°C保持5分鐘。進(jìn)樣口和火焰離子化檢測(cè)器溫度分別為250°C和290°C。每份精油注射1μL，分流比為1:200。
質(zhì)譜分析(GC-MS)
GC-MS分析使用Agilent Technologies-6850 Series II氣相色譜儀（GC），配備DB-5MS（5%苯基甲基聚硅氧烷）柱（60 m x 0.25 mm x 0.25μm）（Agilent Tech.,USA）和HP-INNOWAX柱（60 m x極0.25 mm x 0.25μm）（Agilent Tech.,USA），并配備Agilent 5975B質(zhì)譜選擇性（MS）檢測(cè)器，在全掃描模式下使用，以監(jiān)測(cè)質(zhì)量單位從30到500 m/z，電子轟擊能量為70 eV。使用氦氣作為載氣，流速為1 mL/min。進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為250°C和230°C。四極桿溫度為150°C。使用DB-5MS柱時(shí)的DB-5MS柱溫箱程序?yàn)椋旱谝环昼?20°C，然后以5°C/min升至250°C保持5分鐘，以30°C/min升至320°C保持5分鐘，最后300°C保持5分鐘。使用HP-INNOWAX柱時(shí)的柱溫箱程序?yàn)椋旱谝环昼?0°C，然后以6°C/min升至220°C；最后220°C保持3分鐘。每份精油注射1μL，分流比為1:200，水餾液的注射制備前文已說明。
水餾液氣相中化合物的同時(shí)提取和濃縮使用頂空固相微萃取（HS-SPME）技術(shù)進(jìn)行，使用一根涂有65μm厚PDMS/DVB的熔融石英纖維，購(gòu)自Supelco（美國(guó)賓夕法尼亞州Bellefonte）。色譜分析使用先前使用的相同色譜儀、色譜柱和條件進(jìn)行，except進(jìn)樣以不分流模式使用SPME裝置（美國(guó)賓夕法尼亞州Bellefonte）進(jìn)行。
精油和水餾液成分的鑒定通過將質(zhì)譜與NIST庫(kù)中報(bào)道的質(zhì)譜進(jìn)行比較，以及與正構(gòu)烷烴相關(guān)的保留指數(shù)（由Adams報(bào)道的）以及其他文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)來完成。
ABTS自由基清除活性
通過評(píng)估2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除活性來測(cè)定精油和水餾液的抗氧化活性，如Re等人所述。從Sigma-Aldrich（美國(guó)密蘇里州圣路易斯）獲得的ABTS自由基是通過將20 mg/l ABTS與2.5 mg/l過硫酸鉀（K?S?O?）（Sigma-Aldrich，美國(guó)密蘇里州圣路易斯）在去離子水中混合，在黑暗中于室溫下保持16小時(shí)制備的。其在740 nm處的吸光度調(diào)整至0.73。首先，為每個(gè)樣品制備6個(gè)連續(xù)的2倍稀釋系列，以確定其最佳濃度范圍，并繼續(xù)使用4個(gè)稀釋范圍。這些稀釋液使用乙醇制備，將每種稀釋液10μl加入240μl ABTS中。然后，分別為百里香和迷迭香精油定義了2倍濃度范圍；0.75至6和250至2000μL/L。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在不同的時(shí)間進(jìn)行三次重復(fù)。讀取740 nm處的初始吸光度，然后每5分鐘讀取一次，總共120分鐘。使用公式（%）=[(A?-A)/A?]x 100計(jì)算抑制百分比，其中A?是對(duì)照吸光度（即不含樣品的ABTS），A是含樣品的ABTS在t時(shí)間的吸光度。通過計(jì)算抑制百分比對(duì)樣品濃度作圖，得到使ABTS減少50%所需的樣品濃度（IC??）。使用從Sigma-Aldrich（美國(guó)密蘇里州圣路易斯）購(gòu)買的Trolox（6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸）作為合成抗氧化劑參考。
抗菌活性測(cè)定
微孔稀釋法
采用帶有BIOSCREEN C微生物生長(zhǎng)分析儀（Labsystems，芬蘭赫爾辛基）的微孔稀釋法，如Medina等人所述，用于確定對(duì)Escherichia coli（大腸桿菌）、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）、Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）和Candida albicans（白色念珠菌）的抗菌活性。BIOSCREEN C報(bào)告光密度，代表細(xì)胞生長(zhǎng)引起的濁度。制備150μl細(xì)菌溶液（細(xì)菌使用Mueller-Hinton肉湯（MHB），C.albicans使用麥芽提取物（Oxoid Ltd,英國(guó)Basingstoke,Hampshire）），其中包含工作培養(yǎng)物（制備方法如前所述），然后加入150μl每種精油和水餾液樣品的稀釋液（使用二甲基亞砜（DMSO-Sigma-Aldrich,美國(guó)密蘇里州圣路易斯）制備）。
使用三個(gè)含有300μl單獨(dú)MHB的孔作為陰性對(duì)照，另外三個(gè)孔作為陽性對(duì)照，其中對(duì)E.coli（大腸桿菌）和P.aeruginosa（銅綠假單胞菌）使用慶大霉素（Oxoid Ltd）（100μg/ml），對(duì)S.aureus（金黃色葡萄球菌）使用萬古霉素（Oxoid Ltd）（100μg/ml），對(duì)A.niger（黑曲霉）使用伏立康唑（Sigma-Aldrich,美國(guó)圣路易斯）（10μg/ml），對(duì)C.albicans（白色念珠菌）使用兩性霉素B（Sigma-Aldrich,美國(guó)圣路易斯）（1250μg/ml）。
最后，通過將每種測(cè)試溶液5μl倒入培養(yǎng)皿中，于37°C培養(yǎng)24小時(shí)（針對(duì)E.coli、P.aeruginosa、S.aureus和C.albicans），并應(yīng)用噻唑藍(lán)四唑溴化物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物]（MTT,Sigma Aldrich,美國(guó)密蘇里州圣路易斯）測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞活力（如Mosmann所述），來確認(rèn)最低殺菌濃度（MBC）和最低抑菌濃度（MFC）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在不同的時(shí)間進(jìn)行三次重復(fù)。
瓊脂稀釋法
使用瓊脂稀釋法確定精油和水餾液對(duì)Aspergillus niger（黑曲霉）的最低抑菌濃度（MFC），如Hammer等人所述，并進(jìn)行了修改。將馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基與連續(xù)稀釋的精油和水餾液在極30°C下制備；在其凝固之前，倒入小培養(yǎng)皿中。然后，將一片帶有A.niger（黑曲霉）單孢子培養(yǎng)物（如前所述制備）的圓片置于培養(yǎng)皿中心，并在25°C下培養(yǎng)極5天。MFC定義為無生長(zhǎng)的最低濃度。每個(gè)assay重復(fù)三次，每次三個(gè)重復(fù)。定義MFC的平均值。用單獨(dú)PDA制備三個(gè)陰性對(duì)照，并用伏立康唑10μg/ml制備三個(gè)陽性對(duì)照。用于精油和水餾液的濃度范圍與微孔稀釋法中使用的相同。
統(tǒng)計(jì)分析
進(jìn)行方差分析，并使用SPSS 11程序通過單因素方差分析（ANOVA）評(píng)估變量間差異的顯著性。P<0.01的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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