2.4 低濃度微酸性電解水處理對細胞內(nèi)容物的影響
2.4.1 DNA和蛋白質(zhì)的泄漏
細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的測定是細胞膜完整性損傷的重要評價指標。如圖3所示，與對照組相比，副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后細胞外DNA水平顯著升高，且呈濃度依賴關(guān)系。而細胞外蛋白水平雖然呈增加趨勢，但只有副溶血性弧菌在有效氯濃度為10毫克/升時顯著高于對照組。當?shù)蜐舛任⑺嵝噪娊馑饔糜诩毦鷷r，釋放到細胞外的蛋白質(zhì)和DNA大分子，可作為膜損傷的主要特征物質(zhì)。蛋白質(zhì)與DNA泄露的變化趨勢一致，進一步驗證了低濃度微酸性電解水對細胞膜完整性的破壞。
A-蛋白質(zhì)；B-DNA
圖3 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA滲漏的影響
2.4.2 細胞內(nèi)K+的滲漏
K+是細菌內(nèi)最豐富的陽離子，參與基本的生命活動，并調(diào)節(jié)細胞的滲透壓和氧化還原電位。鉀通道的激活和鉀離子的泄漏與超極化現(xiàn)象密切相關(guān)，K+的泄漏已被用來監(jiān)測抗菌劑造成的細菌膜破壞。如圖4所示，除了腐敗希瓦氏菌在有效氯濃度為1、2毫克/升時，經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后2種細菌的上清液中K+濃度都具有顯著性差異，與膜電位檢測結(jié)果完全吻合。細胞內(nèi)K+的損失會造成多種代謝途徑受阻，破壞細胞滲透壓的調(diào)節(jié)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
圖4 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內(nèi)K+滲漏的影響
2.5 低濃度微酸性電解水處理對細菌膜電位和電導率的影響
膜電位指質(zhì)子通量引起的電化學梯度在細胞膜上產(chǎn)生的電位差，是合成ATP的驅(qū)動力之一。本研究用探針DiBAC4檢測低濃度微酸性電解水對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的膜電位的影響。如圖5-A所示，有效氯濃度為6、10毫克/升的低濃度微酸性電解水處理后2種細菌的膜電位都存在顯著性差異。低濃度微酸性電解水使2種細菌的膜電位降低，導致細胞膜超極化，且呈有效氯濃度依賴性。劉等報道了微酸性電解水可引起腐敗希瓦氏菌和腐生葡萄球菌的超極化現(xiàn)象，與本研究結(jié)論一致。膜電位發(fā)生超極化可能是由于低濃度微酸性電解水處理導致了細胞膜上離子通道的失活和破壞，部分帶電離子跨膜運輸，使膜內(nèi)外電位差增大，極化狀態(tài)加強。
A-膜電位；B-電導率
圖5 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的膜電位和電導率的影響
細菌電導率的變化可以反映其細胞膜通透性的改變，其改變常伴隨著胞內(nèi)小分子物質(zhì)如離子、磷酸鹽等電解質(zhì)的流出。如圖5-B所示，經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后，隨著濃度的增加，副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的電導率相應升高，且與對照組對比都具有顯著性差異。根據(jù)膜電位、電導率和胞外K+含量等通透性實驗結(jié)果，都說明細菌膜內(nèi)外出現(xiàn)離子紊亂，標志著細胞膜通透性的增強，導致細胞功能異常。
2.6 低濃度微酸性電解水處理后細胞內(nèi)活性氧和ATP水平的變化
活性氧是細胞代謝的副產(chǎn)物，過量累積會導致細胞內(nèi)生物大分子的氧化損傷，從而破壞細菌結(jié)構(gòu)和功能。如圖6-A所示，隨著有效氯濃度的增加，2種細菌胞內(nèi)活性氧的含量都逐漸增加。尤其是當有效氯濃度為6和10毫克/升時，活性氧水平顯著高于對照組。有研究報道，微酸性電解水有效地抑制了單增李斯特菌和假單胞菌的抗氧化酶系統(tǒng)的活性。因此，本研究中低濃度微酸性電解水可能破壞了菌體的抗氧化防御系統(tǒng)，導致了活性氧的大量產(chǎn)生和積累，從而誘導細胞膜上多不飽和脂肪酸的過氧化以及蛋白質(zhì)羰基化。而上述2.4.1節(jié)中，細胞外蛋白水平?jīng)]有明顯變化，可能是蛋白質(zhì)很快會與細菌內(nèi)活性氧或低濃度微酸性電解水中氯物質(zhì)發(fā)生反應。
A-活性氧；B-ATP
圖6 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內(nèi)活性氧和ATP的影響
ATP是微生物可利用能量的基本載體。ATP含量的降低會影響菌體的生命活動，抑制其生長和分裂。本研究中ATP的測定采用生物發(fā)光法。如圖6-B所示，與對照組相比，低濃度微酸性電解水可顯著降低細胞內(nèi)ATP濃度，且具有有效氯濃度依賴性。細菌內(nèi)ATP的迅速耗盡，可能是因為低濃度微酸性電解水攻擊細胞膜導致ATP的泄漏；膜電位的消耗引起ATP的合成受阻；以及細胞內(nèi)ATP酶的持續(xù)水解。
2.7 低濃度微酸性電解水處理對細菌超微結(jié)構(gòu)的影響
2.7.1 細胞形態(tài)變化
為了證實低濃度微酸性電解水引起的細菌損傷，采用掃描電子顯微鏡觀察處理后的菌體形態(tài)。對照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌，均表現(xiàn)出典型的革蘭氏陰性桿菌的結(jié)構(gòu)，表面規(guī)則光滑。經(jīng)低濃度微酸性電解水處理的副溶血性弧菌表面出現(xiàn)明顯的凹陷及褶皺，且隨著低濃度微酸性電解水濃度的升高，菌體嚴重皺縮甚至形成不規(guī)則小孔，導致內(nèi)容物泄漏。而腐敗希瓦氏菌經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后表面結(jié)構(gòu)無明顯坍塌，僅在質(zhì)量濃度≥2毫克/升時出現(xiàn)凹陷和皺縮。結(jié)果表明，低濃度微酸性電解水對2種細菌都具有一定的損傷作用，破壞程度呈濃度依賴性。并且在相同濃度下，副溶血性弧菌較腐敗希瓦氏菌表現(xiàn)出更顯著的結(jié)構(gòu)變化。
A-副溶血性弧菌；B-腐敗希瓦氏菌
圖7 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的SEM圖像
注：a-對照組；b-有效氯濃度=1毫克/升；c-有效氯濃度=2毫克/升；d-有效氯濃度=6毫克/升；e-有效氯濃度=10毫克/升。
2.7.2 細胞質(zhì)膜完整性
使用混合熒光染料Syto 9和PI進行菌體染色，檢測經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后細胞質(zhì)膜的通透性變化。低分子質(zhì)量綠色熒光染料Syto 9可以穿透完整和受損的細胞質(zhì)膜，而高分子質(zhì)量紅色熒光染料PI只能穿透受損的細胞質(zhì)膜。對照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌均顯示Syto 9染料的綠色熒光，說明細胞膜是完整的。而經(jīng)低濃度微酸性電解水處理的細菌出現(xiàn)黃色或紅色熒光，且隨著低濃度微酸性電解水濃度的升高，2種熒光比例增加，表明質(zhì)膜完整性受損。并且在相同濃度下，副溶血性弧菌的黃色或紅色熒光比例明顯高于腐敗希瓦氏菌，表明低濃度微酸性電解水對副溶血性弧菌細胞質(zhì)膜完整性的破壞更強。
A-副溶血性弧菌；B-腐敗希瓦氏菌
圖8 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的CLSM圖像
3 結(jié)論
本研究以海蝦中優(yōu)勢致病菌-副溶血性弧菌和優(yōu)勢腐敗菌-腐敗希瓦氏菌為研究對象，探究了低濃度微酸性電解水對純培養(yǎng)及海蝦表面接種菌的殺菌效果以及作用機制。結(jié)果表明，低濃度微酸性電解水對2種菌均具有較強的殺滅作用，殺菌效果呈有效氯濃度依賴性；并且隨著處理時間的增長，低濃度微酸性電解水對蝦表面接種菌的殺滅效果也增強。低濃度微酸性電解水殺滅副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌可能的機制包括：低濃度微酸性電解水破壞細胞膜完整性，導致膜通透性增加，造成DNA、蛋白質(zhì)、ATP、K+等內(nèi)容物的泄漏，激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果證實了低濃度微酸性電解水對細胞外部結(jié)構(gòu)的破壞作用；低濃度微酸性電解水造成細胞膜超極化現(xiàn)象，細菌膜電位的改變干擾細胞正常的代謝活動，從而導致細菌死亡。部分離子通道激活導致K+等電解質(zhì)的泄露正是造成細胞膜超極化的原因之一，而電導率的增加證明了膜內(nèi)外的離子紊亂；低濃度微酸性電解水造成ATP的快速耗盡，抑制細胞的生命活動；低濃度微酸性電解水導致了活性氧的大量產(chǎn)生和積累，造成細胞中生物大分子的氧化損傷，以及細胞膜上多不飽和脂肪酸和膜蛋白的過氧化，從而破壞細菌細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。