結(jié)果
1.化合物C6在細胞培養(yǎng)中減少MNV-1和李斯特菌的胞內(nèi)感染
篩選39種2-氰基-3-丙烯酰胺類DUB抑制劑，發(fā)現(xiàn)化合物C6和E3在細胞培養(yǎng)中對MNV-1和李斯特菌均表現(xiàn)出顯著的抗感染活性，且毒性低于先導化合物G9。C6在5μM濃度下處理8小時后，對MNV-1的復制抑制超過兩個數(shù)量級（從10?TCID50/mL降至10?TCID50/mL），對李斯特菌的胞內(nèi)復制抑制達到載體處理細胞的28.3%。值得注意的是，C6在低濃度（1.0μM）下仍保持顯著活性，表明其高效力。
2.化合物C6的去泛素化酶活性
化合物C6在人類細胞中表現(xiàn)出DUB抑制活性，與先導化合物WP1130相似。在RAW細胞中，C6處理導致多泛素化蛋白質(zhì)水平顯著增加（約3.5倍），表明C6在鼠細胞中也有效抑制DUB活性。Western blot分析顯示，C6處理后，泛素化蛋白聚集體在細胞質(zhì)中明顯增多，這與DUB抑制的預期效果一致。
3.化合物C6對李斯特菌在無細胞培養(yǎng)中生長的影響
在體外肉湯生長試驗中，C6對李斯特菌生長有輕微的劑量依賴性抑制（IC50=25μM），但不影響細菌的總體生長能力（OD600在24小時內(nèi)無顯著差異）。這表明C6的抗感染活性主要通過宿主細胞機制而非直接抗菌作用實現(xiàn)。
4.化合物C6的細胞毒性評估
在多種細胞處理策略下評估C6的細胞毒性。在2.5μM預處理后，于1.0μM C6存在下孵育，細胞活力保持在80%以上（MTT法測定），表明C6具有良好的細胞相容性。細胞形態(tài)學觀察顯示，C6處理細胞無明顯形態(tài)改變，無凋亡或壞死跡象。
5.化合物C6在低濃度和更長暴露時間下的抗感染活性
使用2.5μM C6預處理，隨后在1.0μM C6存在下孵育，C6在感染后8小時顯著抑制MNV-1復制（抑制率>90%），對李斯特菌的胞內(nèi)復制也有顯著抑制作用（抑制率72%）。與先導化合物G9相比，C6在低濃度下活性更優(yōu)，且毒性更低。
6.化合物C6對病原體攝取的影響
光敏感病毒試驗表明，C6不影響MNV-1的攝?。ㄍㄟ^熒光標記病毒測定），表明其抗病毒作用定位于病毒生命周期的后期階段。對于李斯特菌，C6處理減慢了RAW細胞的吞噬作用（吞噬率降低35%），這可能部分解釋了胞內(nèi)細菌復制的降低。
7.化合物C6在小鼠中的藥代動力學分析
代謝穩(wěn)定性試驗顯示，C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，表明其在肝代謝中相對穩(wěn)定。靜脈注射后，C6在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時，血漿濃度在7小時內(nèi)保持較高水平（AUC??∞=128.5μg·h/mL）。與先導化合物G9相比（半衰期1.5小時），C6在體內(nèi)表現(xiàn)出更有利的藥代動力學特性?？诜o藥后，C6的生物利用度為45%，表明其口服吸收良好。這些藥代動力學數(shù)據(jù)支持C6進一步開發(fā)為體內(nèi)治療藥物。
討論
本研究鑒定出化合物C6作為具有前景的抗感染候選化合物。C6在巨噬細胞中抑制DUB活性，增強宿主對MNV-1和李斯特菌的抗感染能力，同時表現(xiàn)出較低的細胞毒性。C6的藥代動力學特性表明其在體內(nèi)應用的潛力：在小鼠肝微粒體中約20分鐘的半衰期雖較短，但靜脈注射后在小鼠體內(nèi)約4小時的半衰期表明其在體內(nèi)相對穩(wěn)定，這歸因于C6對肝微粒體代謝的抵抗性。與先導化合物G9相比，C6的代謝穩(wěn)定性提高，這是由于其結(jié)構(gòu)優(yōu)化減少了代謝位點。
C6的抗感染機制可能涉及多種宿主通路。DUB抑制劑WP1130已知影響巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶的定位和未折疊蛋白反應，C6可能通過類似機制發(fā)揮作用。我們推測，C6抑制特定DUB（如USP25或UCHL1），導致泛素化蛋白積累，激活NF-κB信號通路，增強炎癥因子產(chǎn)生和抗菌肽表達，從而清除胞內(nèi)病原體。鑒定C6抑制的具體DUB及其在感染巨噬細胞中的靶蛋白是未來研究的關鍵方向。
值得注意的是，MNV和李斯特菌都是胞內(nèi)病原體，能在巨噬細胞內(nèi)復制。C6通過增強宿主細胞的抗菌能力，使巨噬細胞重新獲得有效清除感染的能力。這與傳統(tǒng)的靶向病原體的治療策略不同，可能減少病原體產(chǎn)生耐藥性的可能性。在臨床應用中，C6的低細胞毒性（IC50>10μM）和良好的藥代動力學特性使其成為理想的候選藥物。
結(jié)論
化合物C6是具有前景的抗感染候選化合物，它在細胞培養(yǎng)中對MNV-1和李斯特菌表現(xiàn)出顯著的抗感染活性（MNV-1抑制>90%，李斯特菌抑制72%），同時具有較低的細胞毒性（細胞活力>80%）。C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時，這些藥代動力學特性支持其進一步開發(fā)為體內(nèi)治療藥物。
本研究為基于宿主的抗感染治療提供了新思路，表明靶向宿主泛素系統(tǒng)可能是開發(fā)廣譜抗感染藥物的有效策略。未來研究將聚焦于C6抑制的具體DUB、其在感染巨噬細胞中的作用機制，以及在動物模型中的抗感染活性評估。Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀的應用為本研究提供了可靠的細菌生長動力學數(shù)據(jù)，確保了實驗結(jié)果的精確性和可重復性。
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