分子鑒定
通過氯仿/異戊醇方法5從分離株的酵母相中提取基因組DNA(DNA)，用于部分β-微管蛋白(β-tub)和幾丁質(zhì)合酶(CHS)編碼基因的測序1，以及如所述進行T3B聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)指紋分析43。在T3B PCR指紋分析中，對照菌株為巴西孢子絲菌(CBS120339)、墨西哥孢子絲菌(MUM11.02)、申克孢子絲菌(ATCC32286)和球形孢子絲菌(IPEC27135)。在測序分析中，巴西孢子絲菌(CBS120339)、球形孢子絲菌(FMR8600)、墨西哥孢子絲菌(CBS120341)、蒼白孢子絲菌(CBS111110)和申克孢子絲菌(FMR8604)用作來自國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公共Genbank的參考菌株。
巨噬細胞實驗
進行了使用J774巨噬細胞的體外毒力實驗，以確定巨噬細胞吞噬和殺死巴西孢子絲菌酵母的能力，以及這種相互作用后巨噬細胞的活力。44 J774系的巨噬細胞在培養(yǎng)板中以單層生長，在含有10%胎牛血清、10%NCTC-109、1%非必需氨基酸和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基用杜爾貝科改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)稀釋，在37°C，10%CO2條件下，并分到96孔板中。將5株巴西孢子絲菌分離株的酵母細胞，先前通過豚鼠血清補體(MP Biomedicals)孵育30分鐘進行調(diào)理，以5:1的比例添加到巨噬細胞單層中。
體內(nèi)實驗
為了評估體內(nèi)毒力，使用25μL Hamilton®注射器給大蠟螟（Vanderhorst Wholesale,Inc.）幼蟲接種104、106或107個酵母細胞（五種巴西孢子絲菌分離株之一，稀釋在10μL PBS中），并分析幼蟲存活率。40作為對照，一組幼蟲接種了巴西孢子絲菌參考菌株(CBS120339)。陰性對照組包括未接種的幼蟲（“Control”）和注射10μL無菌PBS的幼蟲（“PBS”）。這些實驗在不同日期進行了三次重復。每組由20只幼蟲組成，在90 mm培養(yǎng)皿中于37°C下維持，并每天評估大蠟螟。在0天（接種日）和2天（接種后48小時）對組進行拍照（Canon EOS DIGITAL REBEL）。死亡幼蟲（通過缺乏主動或觸摸誘導的運動且通常顏色變黑來識別）從組中移除并丟棄。獲得生存曲線以比較分離株對幼蟲的影響。
在相同條件下，每組10只幼蟲的平行組用于CFU測定。在接種后3天或6天，處死每組3只幼蟲。將內(nèi)部內(nèi)容物研磨并在2 mL PBS中勻漿，然后通過40μm細胞過濾器過濾。取100μL這種勻漿液鋪在含有0.4 g/L放線菌酮和1%青霉素/鏈霉素的BHI瓊脂上以防止污染，并在37°C下孵育。五天后，測定CFU。
體外推定毒力因子的產(chǎn)生
a.脲酶
為了驗證脲酶產(chǎn)量，將每種分離株相當于2.0 McFarland比濁度的酵母細胞懸浮液0.5 mL接種到4.5 mL Christensen尿素肉湯中，45,46并在37°C下孵育。四天和七天后，將試管以1,575 g離心（Centrifuge 5804R,Eppendorf），并將100 uL上清液一式三份轉(zhuǎn)移到96孔聚苯乙烯平底板（Corning,Tewksbury,USA）中。新型隱球菌(ATCC32045)和近平滑念珠菌(ATCC22019)分別用作陽性和陰性對照。使用Biotek分光光度計（Epoch型號）在559 nm波長下獲得樣品吸光度(O.D.)。
b.蛋白酶
蛋白酶活性按描述測量，使用以下混合物：2%瓊脂，15 mM葡萄糖，13 mM甘氨酸，29.4 mM KH2PO4，10 mM MgSO4，3 mM硫胺素，0.1%azoalbumin(pH 4.5)。對于蛋白質(zhì)瓊脂清除，每種分離株的酵母細胞通過穿刺接種在該混合物上，并在37°C下孵育21天。孵育后，檢查菌落周圍是否產(chǎn)生azoalbumin降解暈圈。當觀察到蛋白水解活性時，用毫米尺測量菌落直徑(p)和azoalbumin降解暈圈直徑(z)，并計算p/z值作為兩個直徑的比率。
c.黑色素
根據(jù)Almeida-Paes等人描述的方法獲得黑色素“幽靈”。48然后通過簡單的DHN-黑色素/酵母干重比(w/w)計算每種分離株的二羥基萘(DHN)-黑色素比例。
耐熱性
每種5株分離株的酵母在37°C的BHI肉湯中生長，3天后，將2 mL酵母溶液離心，重懸于PBS中，并進行10倍稀釋以獲得3種不同的稀釋度。將2.5μL滴液接種在BHI瓊脂平板上，并在35、37或39°C的37900型培養(yǎng)箱中孵育。三天和六天后，定性驗證平板以確定是否存在菌落生長。
生長曲線
5株分離株的巴西孢子絲菌酵母細胞在BHI肉湯(Difco)中于37°C生長3天。根據(jù)Medina等人描述的方法稍作修改，使用Bioscreen C微生物生長曲線分析系統(tǒng)（Labsystems,Helsinki,Finland）連續(xù)評估濁度作為生長的量度。使用制造商提供的Easy Bioscreen Experiment(EZExperiment)軟件記錄數(shù)據(jù)。
對氧化劑的敏感性
每種分離株的真菌細胞（1 x 10<sup>7</sup>個酵母）在37°C的BHI瓊脂斜面上生長5天后收獲，用PBS洗滌3次，并提交給化學生成的一氧化氮、活性氮中間體和氧源性氧化劑，如先前所述。<sup>15</sup>在37°C下與氧化劑孵育1、2、3和4小時后，將酵母鋪在平板計數(shù)瓊脂（Bio-Rad）上，通過CFU計數(shù)確定存活率。未經(jīng)處理的細胞等分試樣也作為對照鋪板。某個時間點每種分離株的存活率是該時間點的CFU計數(shù)/對照CFU計數(shù)的比率，以百分比表示。
抗真菌藥敏試驗
根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)方案，使用分生孢子進行藥敏試驗。使用CLSI描述的用于絲狀真菌（包括申克孢子絲菌）的微量稀釋法M38-A2（0.016-8μg/mL）<sup>50</sup>研究了5株分離株對兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑和特比萘芬的敏感性。將細胞在RPMI 1640中稀釋，最終濃度為2 x 10<sup>4</sup>至1 x 10<sup>5</sup>個細胞/mL。對于兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑，最低抑菌濃度(MIC)終點是產(chǎn)生完全生長抑制的最低濃度。對于酮康唑，MIC是導致生長減少50%的最低濃度，對于特比萘芬，它是導致生長減少至少80%的最低濃度。
統(tǒng)計檢驗
在分析中使用了非參數(shù)檢驗（例如，Kruskal-Wallis檢驗比較生長曲線和CFU，Kaplan-Meier估計量用于大蠟螟的存活率，Log-rank(Mantel-Cox)檢驗用于比較生存曲線）來比較5株分離株，P值<0.05被認為是顯著的。使用GraphPad Prism 6 for Windows,GraphPad Software,Inc.進行圖表構(gòu)建和統(tǒng)計。使用Microsoft Excel 2010/2013(Microsoft Corporation,Redmond,Washington,USA)進行百分比計算和分析。
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