研究簡介
胰腺癌（PC）是全球第三大致死癌癥，其五年生存率僅為9%至11%。盡管手術切除是目前最有效的治療手段，但化療藥物如5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他濱（gemcitabine）在一定程度上可以改善患者的生存率。胰管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（IPMNs）是胰腺囊性腫瘤，也是胰腺癌的重要前體病變。越來越多的證據(jù)表明，IPMNs中可能存在獨特的腫瘤微生物組，但這些微生物的持久性及其對癌癥治療的潛在影響尚不清楚。本研究分析了來自臨床IPMN樣本的細菌分離株，并通過功能性實驗和全基因組測序（WGS）研究了它們與化療藥物的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)分離株能夠降低5-FU和吉西他濱對胰腺癌細胞系（PANC-1、AsPC-1和Capan-2）的細胞毒性。WGS分析顯示，與芽孢桿菌（Bacilli）相比，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）菌株在抗生素抗性、藥物運輸和毒力相關基因上更為豐富。進一步的通路分析表明，γ-變形菌綱在嘧啶代謝通路中更為豐富，而芽孢桿菌則在嘌呤代謝通路中更為豐富。這些發(fā)現(xiàn)表明，IPMN相關細菌具有代謝活性，能夠調(diào)節(jié)化療藥物的療效。研究發(fā)現(xiàn)IPMN相關細菌能夠耐受兩種常用的化療藥物5-FU和吉西他濱，并可能削弱它們對胰腺癌細胞的細胞毒性。通過全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，研究揭示了可能使這些細菌能夠在腫瘤微環(huán)境中持續(xù)存在并代謝化療藥物的潛在適應機制。這些細菌的適應機制可能支持它們在腫瘤病變內(nèi)的生存，并使它們能夠與嘧啶類似物相互作用。這強調(diào)了闡明腫瘤相關微生物在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和治療中的功能角色的重要性。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于監(jiān)測IPMN衍生細菌菌株的生長情況。從胰腺IPMN樣本中分離得到的細菌菌株，經(jīng)過純化后在血平板上培養(yǎng)，挑選出單個菌落進行后續(xù)實驗。將純化的細菌菌落接種于5 mL液體腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基中，在37℃、200 rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)好的菌液進一步稀釋至OD為0.1的濃度，用于后續(xù)的生長曲線測定。取10μL稀釋后的菌液（OD為0.1）與190μL BHI培養(yǎng)基混合，加入到Bioscreen C系統(tǒng)的100孔蜂窩板中，每個菌株設置3個重復孔。將蜂窩板放入Bioscreen C儀器中，在37℃下進行培養(yǎng)。儀器每隔15分鐘自動測量一次菌液在600 nm處的吸光度（OD），以監(jiān)測細菌的生長情況。根據(jù)吸光度（OD）隨時間的變化，繪制細菌的生長曲線。通過生長曲線可以確定細菌的對數(shù)生長期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期，并計算出每個菌株的倍增時間（DT）。
實驗結果
胰腺腫瘤相關細菌對化療藥物的耐受性和代謝能力，揭示了這些細菌如何適應腫瘤微環(huán)境并影響化療效果。研究發(fā)現(xiàn)，IPMN（胰管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤）衍生的細菌對5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他濱表現(xiàn)出不同程度的耐受性，其中多數(shù)菌株對吉西他濱敏感，但對5-FU頻繁耐藥。這些細菌還能代謝這兩種化療藥物，減弱其對胰腺癌細胞的毒性，表明它們具有影響化療效果的內(nèi)在能力。通過全基因組測序（WGS）分析，研究發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）菌株比芽孢桿菌（Bacilli）菌株在功能上更豐富，尤其在能量代謝、膜運輸?shù)韧緩街?。IPMN衍生細菌在嘧啶代謝途徑中基因富集顯著，可能幫助它們在腫瘤微環(huán)境中生存。研究還發(fā)現(xiàn)，不同惡性程度的IPMN衍生細菌菌株間存在大量共同基因，這些基因在嘧啶代謝、小分子代謝過程、DNA修復等途徑中功能富集，表明這些細菌通過這些途徑適應了IPMN環(huán)境。這些細菌的適應機制和代謝能力可能削弱化療藥物對腫瘤細胞的殺傷效果，促進腫瘤進展和化療耐藥性發(fā)展。
圖1、IPMN衍生菌株對5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他濱的敏感性表征。A）IPMN衍生細菌菌株的分類、分離來源以及倍增時間（DT），以及對照菌株大腸桿菌（E.coli）d12和E.coli 25922。B）IPMN衍生細菌菌株和對照菌株的生長曲線。x軸表示時間（分鐘），y軸表示在600 nm處的吸光度（OD）（平均值±標準差，n=3）。C）確定選定IPMN衍生菌株的半數(shù)抑制濃度（IC50）值的實驗設計示意圖，以E.coli d12、E.coli 25922和福賽坦菌（F.nucleatum）菌株作為對照。D）代表性劑量反應曲線，用于計算IPMN衍生的K.oxytoca（H1）在腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基中孵育24小時后的IC50值。數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化、對數(shù)轉(zhuǎn)換，并使用Gompertz方程擬合。E）熱圖顯示了個別細菌菌株對5-FU和吉西他濱兩倍稀釋濃度的反應活性?；钚砸韵鄬τ谖刺幚韺φ战M（設定為100%）的存活率百分比表示（平均值±標準差，n=3）。左側為5-FU，右側為吉西他濱。
圖2、IPMN衍生菌株代謝5-FU和吉西他濱，改變胰腺癌細胞對藥物的敏感性。A）細菌降解化療藥物的實驗設置示意圖。5-FU和吉西他濱與個別細菌菌株一起孵育4小時。孵育后，通過0.2μm濾膜過濾上清液。通過CCK-8實驗評估藥物活性，并測試了4μM和40μM的指定藥物濃度。以未處理的藥物作為對照，計算相對藥物活性。B-C：在與IPMN衍生菌株、E.coli和F.nucleatum共同孵育4小時后，PANC-1和AsPC-1細胞的存活率定量分析?；熕幬?-FU和吉西他濱（40μM）首先與IPMN衍生菌株一起孵育4小時，過濾、稀釋后加入癌細胞培養(yǎng)中。細胞存活率在CCK-8實驗中測量，并在48小時后以相對于未處理細胞的百分比存活率表示。D）熱圖總結了PANC-1、AsPC-1和Capan-2細胞系相對于活性藥物處理的細胞存活率百分比增加情況。
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