摘要
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在工業(yè)發(fā)酵時(shí)面臨的噬菌體污染是行業(yè)難題。以飼料中常用的枯草芽孢桿菌K28為宿主分離得到一株裂解性噬菌體PJNB028，對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性測(cè)定、全基因組注釋和系統(tǒng)進(jìn)化分析和抗性菌篩選。PJNB028可在宿主菌平板形成圓形、透亮、邊緣清晰且有暈環(huán)的噬菌斑。PJNB028攜帶162 308 bp的線性雙鏈DNA，G+C含量為34%，含有237個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，屬于Caudoviricetes綱。最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為1，較為耐酸不耐堿(pH 3~11)，對(duì)紫外線較敏感;PJNB028的潛伏期為10 min，爆發(fā)期為70 min，爆發(fā)量為291 PFU/cell;在70~80℃高溫下處理1 h效價(jià)明顯降低，37℃作用8 h噬菌體對(duì)枯草芽孢桿菌繁殖體具有良好的抑菌效果。PJNB028能裂解莫哈韋芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等50%(n=20)的芽孢桿菌。通過(guò)噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)篩選出3株抗性菌株，部分抗性菌株在發(fā)酵中表現(xiàn)出更高的α-淀粉酶活性及菌株效價(jià)。根據(jù)PJNB028生物學(xué)特性和基因組分析，可使用抗性菌株或結(jié)合熱堿液、高溫滅菌和紫外線消毒等防控噬菌體，為以后防治芽孢桿菌噬菌體污染提供了可靠的研究素材。
枯草芽孢桿菌是一種廣泛存于自然環(huán)境的好氧桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌，具有抑菌、耐酸、耐高溫和耐膽鹽等益生特性?？莶菅挎邨U菌在工業(yè)微生物領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值，是國(guó)際上公認(rèn)的益生菌，只有單層細(xì)胞外膜，能將蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，合成多種酶、核苷酸及抗生素等多種有機(jī)大分子物質(zhì)，是多種酶類的理想原核表達(dá)宿主?？莶菅挎邨U菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)簡(jiǎn)單，作為飼料添加劑能有效改善腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡。
噬菌體是感染細(xì)菌、真菌的病毒，分布十分廣泛，在治療臨床多重耐藥病原菌、控制加工食品致病菌的應(yīng)用上具有巨大潛力。了解噬菌體的生物學(xué)特性，通過(guò)對(duì)其侵染和裂解機(jī)制的研究，篩選抗噬菌體菌株發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌，是防止枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中被噬菌體污染的必要環(huán)節(jié)。
早在1961年，研究者們就開(kāi)發(fā)了一種直接分離枯草芽孢桿菌噬菌體的簡(jiǎn)化程序。近年來(lái)，枯草芽孢桿菌噬菌體的多樣性逐漸被開(kāi)發(fā)，已鑒定的最小裂解性噬菌體vB_BsuP-Goe1，基因組僅18 379 bp;裂解噬菌體φ29是研究病毒DNA包裝、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程的模型。通過(guò)觀察枯草芽孢桿菌感染噬菌體，研究者首次提供了噬菌體吸附和將基因組轉(zhuǎn)移到革蘭氏陽(yáng)性菌結(jié)構(gòu)變化的可視化，將枯草芽孢桿菌噬菌體建立為模型系統(tǒng)可能有助于更好地了解炭疽桿菌、蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等的噬菌體。
枯草芽孢桿菌噬菌體在食品工業(yè)中備受關(guān)注，一方面它可能會(huì)阻礙細(xì)菌發(fā)酵從而造成經(jīng)濟(jì)損失，如其在韓國(guó)大豆發(fā)酵中暴發(fā)的普遍性高。另一方面，噬菌體療法能靶向清除細(xì)菌生物膜，從而降低食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)，這種生物控制策略在食品加工中是一項(xiàng)新的“綠色”技術(shù)。
本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，分離得到了一株枯草芽孢桿菌噬菌體PJNB028，對(duì)其生物學(xué)特性和基因組特性進(jìn)行了研究和分析，為枯草芽孢桿菌發(fā)酵污染防控提供研究素材。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1宿主菌與噬菌體來(lái)源
枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和莫哈韋芽孢桿菌等由實(shí)驗(yàn)室分離保存，采用雙層平板法從土壤浸出液中分離噬菌體，純化后的噬菌體與60%甘油1∶1混合后置于-80℃長(zhǎng)期保存。
1.1.2主要試劑和儀器
LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母粉購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，氯化鈉(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，瓊脂購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PCR儀購(gòu)自賽默飛世爾科技公司;超速離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司;水浴鍋購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;動(dòng)態(tài)吸收光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。
1.2方法
1.2.1噬菌體分離與純化
將10 g土壤和20 mL蒸餾水混合，12 000×g離心10 min，使用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾上清液后，雙層瓊脂平板法檢測(cè)濾液中噬菌體。取100μL枯草芽孢桿菌菌液和500μL污水濾液在5 mL EP管混勻，加入50℃LB半固體(按體積加入0.6%瓊脂粉)培養(yǎng)基，快速顛倒混勻倒在事先準(zhǔn)備好的LB瓊脂底板上，待上層半固體凝固后放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~12 h，肉眼觀察噬菌斑形態(tài)及大小。
挑取單個(gè)噬菌斑放入10μL SM液吹打均勻，100μL菌液和4 mL 50℃LB半固體培養(yǎng)基混合倒入LB底板，待上層瓊脂凝固后點(diǎn)斑，置于37℃培養(yǎng)箱中待噬菌體長(zhǎng)出后挑取單個(gè)噬菌斑擴(kuò)培，重復(fù)5次以上至平板上存在大小形態(tài)比較一致的噬菌斑，挑取單個(gè)噬菌斑接入處于對(duì)數(shù)期的宿主菌菌液中，培養(yǎng)至菌液澄清后過(guò)濾，4℃保存。
1.2.2噬菌體基因組分析
使用OMEGA病毒DNA試劑盒提取噬菌體DNA，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用SPAdes軟件進(jìn)行序列拼接。將拼接完成的全基因組序列提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用在線平臺(tái)RAST(https://rast.nmpdr.org)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，獲得噬菌體的全基因組注釋信息，將其氨基酸序列逐一使用blast在線blastp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)的基因進(jìn)行注釋。使用SnapGene軟件繪制整個(gè)噬菌體基因組。使用tRNAscan-SE(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)搜索tRNA序列，用CARD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://card.mcmaster.ca/analyze/blast)識(shí)別毒力基因和耐藥基因，使用MEGA5.0軟件繪制全基因組進(jìn)化樹(shù)和末端酶大亞基進(jìn)化樹(shù)。
1.2.3最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的宿主菌按5%接種量加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后取出進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，將保存的噬菌體原液測(cè)效價(jià)后梯度稀釋，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)為10μL、1μL、0.1μL、0.01μL、0.001μL將100μL噬菌體液和100μL對(duì)數(shù)期枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行混合，加入4.8 mL LB液體培養(yǎng)基放入細(xì)菌瓶培養(yǎng)2 h后，12 000×g離心10 min，上清液用0.22μm濾器過(guò)濾，使用雙層平板法測(cè)定不同MOI的噬菌體效價(jià)。通過(guò)計(jì)算得出最佳MOI。試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.4一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將噬菌體液與宿主菌菌液按最佳MOI混合，于溫箱37℃靜置10 min進(jìn)行噬菌體吸附。10 000×g離心1 min，棄上清液并用LB液體培養(yǎng)基將沉淀重懸，加入37℃提前預(yù)熱的10 mL LB液體培養(yǎng)基充分混勻，置于37℃搖床中180 r/min培養(yǎng)。同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在0 min和每隔10 min時(shí)取樣，12 000×g離心2 min，測(cè)定上清液中噬菌體效價(jià)，每組重復(fù)3次，繪制一步生長(zhǎng)曲線。
1.2.5噬菌體溫度穩(wěn)定性測(cè)定
取噬菌體原液各1 mL置于不同溫度(37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)的水浴鍋中處理30 min、60 min后，通過(guò)雙層瓊脂平板法測(cè)定效價(jià)。試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6噬菌體保存pH穩(wěn)定性測(cè)定
將SM緩沖液pH調(diào)整為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12并高壓滅菌，將100μL噬菌體液置于不同pH的SM緩沖液中，置于37℃搖床孵育1 h后，12 000×g離心10 min收集上清液，測(cè)定噬菌體效價(jià)，不同pH重復(fù)3次。
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